副溶血弧菌噬菌体的吸附材料选择及其吸附和洗脱作用

公司。

1.2.2 培养基。

上层琼脂半固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂15 g，补陈海水至1 000 mL，pH为7.4～7.8，混匀，高压蒸气灭菌，121 ℃，20 min。

下层琼脂固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂7 g，补陈海水至1 000 mL，混匀，调整pH至7.4-7.8，高压蒸气灭菌，121 ℃，20 min。

1.3 副溶血弧菌液和噬菌体悬液的制备

将一定量的副溶血弧菌菌液接种LB 平板，30 ℃条件下培养约24 h，用无菌海水洗下，并用血球计数板计数，计算副溶血弧菌液浓度。副溶血弧菌噬菌体PI 的制备和纯化参照《分子克隆实验指南》[14]。副溶血弧菌菌液为2×107 CFU/mL，副溶血弧菌噬菌体悬液为1.0×1013 PFU/mL，试验时稀释使用。

1.4 4种吸附剂吸附和洗脱效果试验 选择4种吸附剂：滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石、玻璃纤维。

吸附剂的量除了滑石粉2.7 g+硅藻土0.9 g外，其余都为3 g ，分别加入20 mL 1.1×1010、4.6×109、1.1×108、4.7×107和5.8×106 PFU/mL的噬菌体（pH 4.0），搅拌后吸附30 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，再向沉淀中加入10 mL灭菌海水（pH 4.0），洗脱30 min后3 000 r/min离心10 min，回收上清液，合并2次上清液。再向沉淀中加入20 mL的3%的牛肉浸膏（pH 10.0），洗脱30 min，3 000 r/min离心10 min，收集洗脱液。每组做3个平行，采用双平板法测定上清液和洗脱液的噬菌体量（噬菌体效价）。洗脱效果用回收率表述，计算公式如下：

1.5 考察蒙脱石吸附效果的单因素试验及正交试验

向吸附剂蒙脱石（用量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、20、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 g）中加入噬菌体液20 mL（pH 4.0，浓度4.6×109 PFU/mL），吸附30 min后，3 000 r/min离心10 min，回收上清液；将离心后的蒙脱石置于100 mL的灭菌海水（pH 4.0）中搅拌均匀，洗脱30 min，3 000 r/min离心10 min，回收洗脱液。采用双平板法测定上清液和洗脱液的噬菌体量。通过改变蒙脱石的量、吸附时间和吸附pH等参数进行考察蒙脱石吸附效果的单因素试验及正交试验。试验时每组做3个平行。

1.6 数据统计与分析

使用 SPSS 17.0 软件分析样品之间指标的差异。差异显著水平α= 0.05，结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 4种吸附剂的吸附效果

由表1可知，4种吸附剂的吸附率从高到低依次为：活性炭、蒙脱石、滑石粉+硅藻土、玻璃纤维。由表2可知，玻璃纤维的洗脱效果最好，洗脱率达91666 7%，吸附噬菌体效果不好，回收率仅21.818 2%；蒙脱石的洗脱效果次之，活性炭最差。因此，选择蒙脱石作为吸附材料进行进一步研究。

2.2 蒙脱石的吸附效果

2.2.1 蒙脱石用量对吸附效果的影响。

从图1可以看出，随着蒙脱石用量的逐渐增加，其洗脱液噬菌体量也逐渐增大，当蒙脱石用量增至0.5 g时，其洗脱液噬菌体量达到最大值，为5.1×108 PFU/mL，同时其上清液噬菌体量为2.2×107 PFU/mL，当蒙脱石用量继续增大时，洗脱液噬菌体量则不断降低，因此蒙脱石最佳用量为0.5 g。

2.2.2 吸附时间对吸附效果的影响。

从图2可以看出，当吸附时间为0.5 h时洗脱液噬菌体量为6.7×108 PFU/mL，此后随着吸附时间的增加，洗脱液噬菌体量不断减少；当吸附时间为2 h 时，洗脱液噬菌体量达到最大值（7.8×108 PFU/mL）。洗脱液噬菌体量随着吸附时间的不断延长而减小。由此可见，当吸附时间为2 h时吸附效果最佳。

2.2.3 吸附液pH对吸附效果的影响。

从图3可以看出，当吸附液pH为6.0时，洗脱液噬菌体量达到最大值（6.0×108 PFU/mL），此时吸附效果较好。

根据以前的研究成果[13]可知，此噬菌体的最适pH范围为7.5～8.5，其存活的pH范围较宽，除了pH 9.0外，在pH 6.0～11.0时均比较稳定，其成活率在80%以上。当pH在8.0左右时最为稳定，存活率最高，活性最强。对pH 4.0以下的酸性环境耐受性较差，对存活率有明显影响。

该试验结果表明，当吸附液的pH为6.0时，洗脱液噬菌体量为6.0×108 PFU/mL，与吸附液的pH为8.0时的洗脱液中噬菌体的量（5.9×108 PFU/mL）基本相同，究其原因可能与此噬菌体的pH耐受有关。

2.3 正交试验

通过以上单因素试验，在正交試验中选择3个因素：吸附液pH、吸附时间、蒙脱石用量。对每个因素分别设置3个水平，进行正交试验。正交试验因素与水平设计如表3所示。正交试验结果见表4。

由表4可知，根据各因素极差大小可知，各因素对吸附效果的影响从大到小依次为吸附液pH、蒙脱石用量和吸附时间。当吸附液pH为6.0、吸附时间为1 h、蒙脱石用量为0.5 g时，综合得分最高，吸附效果最好。

3 结论与讨论

3.1 吸附材料的选择

笔者选取滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石和玻璃纤维作为吸附剂，进行噬菌体的吸附法固定。滑石粉-硅藻土水体病毒浓缩方法是张楚瑜等[15]在1983年发展起来的，该方法测得的病毒回收率为54.2%～98.2%，平均回收率为83.5%。赵淑敏等[16]用滑石粉-硅藻土浓缩法测得病毒回收率为35.48%～50.12%，发现试验操作时间长、结果稳定性差、需设备复杂。该试验采用滑石粉-硅藻土吸附噬菌体所得到的回收率远远低于张楚瑜等[15]和赵淑敏等[16]测得的回收率，故排除滑石粉-硅藻土这种吸附材料。Jothikumar等[17]用顆粒状活性炭（GAC）填充的滤柱成功吸附饮用水样中的肠道病毒、戊型肝炎病毒（HEV）和轮状病毒，结果表明活性炭对不同浓度噬菌体的吸附作用的回收率一直较低，故也予以排除。

郑耀通等[18]开发并优化钠化蒙脱石吸附病毒浓缩方法，对肠道病毒 PV1、大肠杆菌噬菌体、植物病毒 TMV 在3种不同水体环境中的回收率分别为90.5%、88.3%、94.1%。樊志成等[19]研究表明蒙脱石原料药制剂对大肠杆菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄糖球菌和轮状病毒以及胆盐都有较好的吸附作用，对细菌毒素也有固定作用。该试验中蒙脱石吸附噬菌体的回收率（87.15%）与郑耀通等[18]研究结果相差不大，所以可以考虑蒙脱石作为吸附材料。

玻璃纤维对噬菌体的吸附效果较好，回收率也较高，故也可考虑将其作为一种吸附材料。该试验结果表明，由于吸附同样多的噬菌体，需要玻璃纤维的量远远大于蒙脱石的量，且玻璃纤维操作较为繁琐，因而，从成本及可行性来看，选取蒙脱石作为后续试验的吸附剂。

3.2 蒙脱石的吸附作用

该试验选取吸附液pH、吸附时间及吸附剂用量3个因素对蒙脱石吸附噬菌体进行了研究。结果表明，随着蒙脱石用量的逐渐增加，其洗脱液噬菌体量逐渐增大，当蒙脱石用量增至0.5 g时，其洗脱液噬菌体量达到最大值；当蒙脱石用量继续增加时，洗脱液噬菌体量不断减小，因而确定蒙脱石最佳用量为0.5 g。在其他条件确定的情况下，当吸附时间为0.5 h时洗脱液噬菌体量较大，此后随着吸附时间的增加，洗脱液噬菌体量不断减少；当吸附时间为2 h 时，洗脱液噬菌体量达到最大值，此后随着吸附时间的不断延长，洗脱液噬菌体量不断减小，因而，当吸附时间为2 h时，吸附效果最佳。该试验结果与韩秀山等[20] 关于Bt原毒素在蒙脱石上的吸附0.5～1.0 h就能达到平衡的结论相差不大。该试验结果表明，在其他条件一定的情况下，当吸附液pH为6.0时洗脱液噬菌体量达到最大值，此时吸附效果较好。熊正为等[21]在蒙脱石吸附铀试验中发现，当溶液pH为5.0～6.0时，蒙脱石对铀的吸附率最大，与该试验结果相一致。此噬菌体的最适pH为7.5～8.5，其存活的pH范围较宽，除pH 9.0外，当pH为6.0～11.0时均比较稳定，成活率在80%以上，pH 8.0左右时最稳定，存活率最高，活性最强，对pH 4.0以下的酸性环境的耐受性较差，对存活率有明显影

响[13]。该试验结果表明，当吸附液的pH为6.0和8.0时，洗脱液噬菌体量基本相同，究其原因可能与此噬菌体的pH耐受有关。

该试验选取吸附液pH、吸附时间和蒙脱石用量3因素进行正交试验，结果表明，当蒙脱石用量为0.5 g、吸附时间为1 h、吸附液pH为6.0时，蒙脱石对噬菌体的吸附效果最佳。

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