从检验学角度探讨人体皮肤菌群

摘要：皮肤是一个复杂的微生态系统，正常情况下，细菌群落的种类和数量存在动态平衡，菌群之间的相互抑制及促进作用维持着皮肤的正常状态。受内外界因素的影响，皮肤屏障功能受到破坏，表现为炎症、感染等皮肤问题时，会导致皮肤正常菌群的失调、多样性改变和致病菌的生长繁殖。本文介绍几种获得皮肤菌群的检测手段，探讨皮肤菌群之间的作用机制及影响菌群分布的影响因素，对常见皮肤问题（湿疹、痤疮）中皮肤菌群的变化进行综述。从多个方面了解皮肤菌群以及微生物在健康人及皮肤疾病中的重要组成及地位，利用皮肤常驻菌与致病菌之间的相互关系及作用机理抑制致病菌的生长，从而为微生态治疗提供依据及用药指导。

关键词：皮肤细菌;检测方法;菌群平衡;微生态治疗

中图分类号：R378                                     文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.018

文章編号：1006-1959（2019）01-0053-03

Exploring Human Skin Flora from the Perspective of Testing

LI Min1，SONG Jia-chun2，WANG Hu-ming1

（1.Department of Clinical Laboratory，Baotou Cancer Hospital，Baotou 014030，Inner Mongolia，China;

2.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Baotou，Baotou 014030，Inner Mongolia，China）

Abstract：The skin is a complex micro-ecological system. Under normal circumstances， there is a dynamic balance between the types and numbers of bacterial communities， and the mutual inhibition and promotion between the bacteria maintains the normal state of the skin. Under the influence of internal and external factors， the skin barrier function is destroyed， which is manifested as skin problems such as inflammation and infection， which may lead to the imbalance of the normal flora of the skin， the change of diversity and the growth and reproduction of pathogenic bacteria. This paper introduces several methods for obtaining skin flora， discusses the mechanism of action between skin flora and the influencing factors affecting the distribution of bacteria， and reviews the changes of skin flora in common skin problems （eczema， acne）. Understand the important composition and status of skin flora and microorganisms in healthy people and skin diseases from various aspects， and use the mutual relationship between skin resident bacteria and pathogenic bacteria to inhibit the growth of pathogenic bacteria， thus Ecological treatment provides the basis and medication guidance.

Key words：Skin bacteria;Detection method;Flora balance;Microecological treatment

皮肤是人体最大的器官，作为主要的屏障系统，起着非常重要的隔离、保护作用。皮肤表面及与外界相通的腔道中存在数量庞大的细菌，皮肤一方面通过物理屏障作用阻止微生物的入侵，另一方面发挥着固有免疫和适应性免疫的免疫屏障作用[1]，是人体重要的一道保护防线。在长期的相互适应环境中，细菌对人体造成的“威胁”铸就了其复杂的免疫力。可见，正常菌群是人体健康所必须的[2]。人类皮肤表面不同细菌之间存在抑制与促进的关系，这种抑制与促进的关系表现为细菌数量与种类存在一定程度的动态平衡[3]。当平衡遭到破坏，将导致皮肤屏障功能的破坏，产生皮肤问题，因此皮肤微生态菌群的研究已经成为皮肤疾病诊断、治疗中的热点问题。2007年，人类微生物组计划在美国国立卫生院（NIH）的带领下正式启动，通过高通量测序技术对人体皮肤、鼻腔、口腔、肠道和阴道5个不同部位的微生物群落进行分析，目的是应用这一技术全面了解人体微生物群落的特点[4]。随着分子生物学技术的飞速发展，特别是高通量DNA测序技术的进步，人们对人体微生物菌群的研究更加深入、全面。目前，皮肤检测手段发展到这一阶段经历了快速的技术变革，现将较常用的检测手段以及所获得的皮肤菌群知识综述如下。

1皮肤微生物检测技术

微生物检测技术是获得微生物特征信息的手段，从传统的培养技术到最新的高通量测序平台的建立，实现了对细菌有限数量到细菌微环境的检测。细菌检测方法正得到不断的发展和更新，以往因技术欠缺所导致微观领域认识不足等问题得到改观。检测方法的选择要根据检测目的、原理、成本及操作等多方面条件考虑进行选择。

1.1传统医学实验室检测  以往的医学临床实验室细菌检测多采用培养学方法，即用人工方法将采集的标本接种于营养培养基上，提供细菌生长所必须的外界条件：适宜温度、湿度、气体环境等，符合特定条件的细菌则能生长繁殖。该方法检测成本低，检测周期较长，一些生长条件要求苛刻的细菌很难在常规条件下培养出来。有报道称，皮肤上近99%的细菌是不能在普通培养基上培养出来的[5]。这类培养的鉴定过程是通过细菌形态和生化反应等表型鉴定方法进行的，相比于分子生物学方法，后者的鉴定结果更为可靠。

1.2 DNA测序技术  在原核微生物中，16S rRNA基因是编码16 rRNA相對应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，在结构和功能上16S rRNA具有高度的保守性和特异性，还具有“种”间多态区[6]，因此，分析其序列可确定各种细菌的进化距离和相互关系。目前，已有上千种细菌的16S rDNA序列被测定，并载入基因库。测序技术能够克服传统鉴定过程中生化反应的多种局限性，对疑难细菌的鉴定尤为重要。测序技术目前已经发展到第二代，又称新一代测序技术，相比于第一代的优点是能够快速、低成本地处理几百万基因序列信息，这种单次运行处理海量序列数据的能力是它的突出特点，故又称为高通量测序技术[7]。目前使用最为广泛的3种主流测序技术有Roche/454焦磷酸测序仪、Genome Analyzer（Illumina GA）测序仪和Biosystems SOLiD基因测序仪，在基因组学中具有里程碑意义。

1.3质谱技术  基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）是将样品（细菌、真菌）混入基质分子中使其形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，样品电离后在电场作用下飞过真空的飞行管，通过离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。离子质量电荷之比（M/Z）为横坐标，飞行时间检测器探测到的离子峰为纵坐标，绘制质谱图，经软件与质谱数据库进行比较，根据特异图谱实现对目标微生物属、种及亚型的区分和鉴定[8]。该技术可将完整病原菌细胞直接检测，但是为降低细菌样本复杂性，需要对检测样本进行增殖或富集处理。该方法鉴定过程仅用10 min甚至更短时间，耗材成本较传统鉴定法低3～5倍[9]。菌库大，对常规条件下难鉴定的细菌有较好的鉴定效果。

2正常皮肤菌群

人类皮肤细菌可分为两大类：①常居菌（Resident microorganisms）：也称固有性细菌，是人体表面数量及种类较固定的微生物群体。在皮肤环境变化菌群受到干扰的情况下，能够重新建立原有菌群构成。Grice EA等从健康成人20个不同皮肤位置进行采样，采取高通量测序手段发现常居菌主要分为四门：放线菌门（52%）、厚壁菌门（24%）、变形菌门（17%）和拟杆菌门（7%）[10]。主要包括：表皮葡萄球菌、需氧性孢子菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、糠秕孢子菌属、类白喉杆菌属等。②暂居菌（Transient microorganisms）：来自于外部环境，寄居在皮肤表面几个小时到几天后消失，不建立永久定植，这类细菌有革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、八叠球菌、链球菌属等，还包括变形杆菌及肠杆菌科大肠杆菌及粪产检杆菌等。宿主正常的卫生状况、免疫状态、完好的皮肤屏障功能等正常状态下，常居菌和暂居菌是不会致病的。然而，多重因素影响宿主的正常状态时，这两类细菌都有可能成为致病菌，增殖并引发疾病的发生。例如，表皮葡萄球菌是皮肤常居菌，在免疫力低下的患者中可能引发机会性致病。此外，一般情况下，金黄色葡萄球菌为暂居菌，在部分人群中金葡菌可成为无症状带菌者的常驻微生物，同时也是重要的病原体[11]。

3影响皮肤菌群分布的因素

皮肤构造的影响及分泌的化学物质不同，导致不同个体皮肤微环境存在差异，这是皮肤菌群分布的主要影响因素。皮肤的解剖构造，如皮沟、皮嵴等为细菌提供了一个独特的微生态栖息场所。皮脂腺、汗腺、毛囊等皮肤附属结构的特殊凹陷及功能为细菌生长提供不同的物质及环境条件。人类皮肤根据性质不同，分为皮脂溢出部位、潮湿部位和干燥部位，这是影响皮肤菌群的一类重要因素。高通量测序显示不同性质皮肤表面细菌分布的种类差异很大，如正常人潮湿部位多定植革兰氏阳性的葡萄球菌、微球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌等[12]。皮脂分泌旺盛部位为适合厌氧环境的亲脂性丙酸杆菌和亲脂性真菌马拉色菌占优势[13]。干燥部位定植的细菌较为丰富，以葡萄球菌、丙酸杆菌、微球菌、棒状杆菌、链球菌多见[14]。另外，影响皮肤菌群分布的其他因素有：地理因素导致的紫外线差异、气候、气温，过量饮酒导致营养和维生素缺乏降低机体免疫力和皮肤屏障功能，个人卫生习惯和护肤品的选择以及同一个体不同pH值及温度等[15]。

细菌与细菌之间存在复杂的抑制、促进的关系，这种关系在菌群多样性的产生和维持中发挥着重要的作用。抑制是通过竞争及拮抗作用来实现。微生物拮抗作用是指一种微生物在其生命活动中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其它微生物的生长繁殖，甚至杀死其它微生物的现象。常驻菌群能够降低皮肤酸碱度，维持皮肤酸性环境为pH 3～5，以此抑制病原微生物的入侵和繁殖[5]，如痤疮丙酸杆菌在某种程度上通过分解皮脂脂质释放脂肪酸，脂肪酸所产生的酸性环境不利于金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的繁殖，还能抑制耐甲氧西球菌和棒状杆菌的生长，一定程度上抑制了致病菌的生长。表皮葡萄球菌则通过引起脂质膜渗漏和促进宿主产生抗菌肽（AMPs）等机制抑制致病菌的生长[16]。丙酸杆菌和表葡作为正常菌群共同对致病菌起到抑制作用，在一定程度上控制了致病菌数量，这两种正常菌之间为促进关系。

4常见皮肤问题中菌群变化

目前，对湿疹、痤疮患者与正常人对比研究发现细菌分布构成有所改变。湿疹是由多种内外因素引发，以瘙痒为特征的皮肤炎症反应，易反复、难治愈，是一种常见的皮肤疾病。王华等研究表明[17]，湿疹患者的皮损部位金黄色葡萄球菌和马拉色菌的定植率显著高于正常人，并且与湿疹的渗出性炎症的严重程度呈正相关。使用抗菌药物针对性控制病原菌感染的种类和数量，能明显消除湿疹患者的炎症反应，调节细菌种类在改善湿疹症状及治疗效果中有较好的作用。痤疮（俗称青春痘）是最常见的皮肤病，是毛囊、皮脂腺的炎症性疾病，在青少年中有85%的发病率。目前普遍认为这类皮肤问题与痤疮丙酸杆菌存在密切关系。正常条件下，常驻菌痤疮丙酸杆菌有助于皮肤健康状态的维持，这类菌通过分解皮肤脂质产生游离脂肪酸，维持了皮肤酸性pH，抑制了致病菌的繁殖。当雄激素上升时，皮脂腺分泌旺盛，痤疮丙酸杆菌过度增殖，通过分泌脂酶、蛋白酶、透明质酸酶等分子导致毛囊、皮脂腺组织破裂，诱发产生促炎性细胞因子和中性粒细胞趋化因子，激活经典途径和补体旁路替代途径，导致炎症的发生[18]，此时，对皮肤健康起到关键作用的痤疮杆菌由于菌群结构的变化引发炎症反应，导致条件致病。

5展望

随着微生物检测技术的发展，人们对皮肤菌群研究得到更加深入的认识。皮肤表面菌群数量及多样性有助于皮肤病的诊断和治疗。目前，微生物受内外界影响的因素得到不断地揭示，作用机制了解还不够全面，有待于进一步的研究。正常与异常皮肤菌群构成做分析、对比，这一关系可以指导临床应用，一种是对病原菌进行针对性治疗，使用抗生素抑制致病菌生长繁殖。另一种是在感染部位人为加入微生物制剂（益生菌）限制致病菌的繁殖，减少致病菌对机体的进一步侵害，这种治疗方法为目前较为热门的微生态疗法[19]。微生态疗法能够改变皮肤菌群，促进正常菌群的恢复，对宿主产生有益的治疗效果，能够开发局部皮肤益生菌药剂，帮助恢复皮肤屏障是今后皮肤微生物研究的主要方向。

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